少年強則國強，

不是，說錯了。

應該是大爺、大媽強則國強

世界看中國，中國看北京

北京看大爺，大媽

簡直是金庸筆下的武林高手

各種絕學來領教一下

倒掛金鉤

這曼妙的身姿我是徹底服了

這是在傳輸內功

秋千升級版

少林鐵襠功果然名不虛傳

翻云掌

再看看這個

第一次我小編沒看明白怎么上去的

絕對是“小區扛把子”

“風一樣的男子”

公交俠

再看看這個

您不怕死，能不能不害別人呢？

這個大家都知道什么武功了

鐵頭功

這是壓力多大啊

這個年紀真不該承受這么大的壓力

千里鞭雷”

甩出了波音飛機才有的音爆效果

再來看看神功蓋世的大媽

隱隱感覺背后搖扇子的大爺深不可測

你以為大媽花拳繡腿

其實她在不斷解鎖新的健身技能

你以為大媽是在表演

其實是在教徒弟

這是雙人的修煉

個中精彩，人間罕見

這對兒小伙伴的“無敵風火輪”

當真是神乎其技，顛倒眾生

倒拔垂楊柳”

小編想問問

賠錢了么嗎？

知道自己多少斤不

這個妹妹好功夫

誰娶到她真是性福了

還有這個小姐姐

好了，武功秘籍，就傳授到這

再看到健身器知道怎么練了吧

摘  要 生物監測是環境監測重要部分，當前我國環境監測主要依賴化學分析監測，近年來雖然國際上生物監測技術發展比較迅猛，但基于我國環境監測標準限制，我國生物監測發展一直處于研究階段，當前生物監測主要依賴于藻、溞和魚類水生生物物種，對于大型底棲生物目前監測僅依賴于生物多樣性調查，因此亟待發展我國水生實驗生物，尤其需要加強大型底棲生物生物標志物篩選以及模式化研究。因此本文采用我國廣泛分布的軟體動物河蜆作為實驗生物，為加強其背景生物學研究，系統研究了河蜆生物標志物，最后利用上述標志物探討了環境污染物對河蜆作用機制。 主要研究內容與結果如下： 1）利用Illumina技術獲得了河蜆miRNA信息轉錄組信息，獲得了28799934條高質量序列，鑒定了45條保守的和39條新的河蜆miRNAs；熒光定量PCR定量結果表明12個miRNA中9個miRNAs在腹足中表達量最高，而miR-10和Novel-2各自在鰓和內臟團中表達最高；預測軟件結果發現miRNAs和環境污染相關基因相關，為河蜆作為實驗生物提供了分子生物學基礎。 2）采用RACE技術，成功克隆獲得河蜆CCK, Conopression和FFamide的全長 cDNA 序列， 預測了河蜆CCK, Conopression和FFamide蛋白的分子結構特征，并分析了神經肽在河蜆不同組織中的表達分布；有機磷酸酯對神經肽顯著調節，表明了CCK, Conopression和Ffamide適合作為河蜆生物標志物，為環境污染物生物監測提供技術手段。 3）結合轉錄組測序技術和熒光定量PCR技術分析了典型有機磷酸酯（TDCPP和TBP）毒理作用機制，多指標結果表明長期低劑量暴露下，主要影響相關通路為凋亡通路、黏著斑通路、小細胞肺癌通路、細胞黏附分子通路，酶活指標和凋亡相關基因指標證實了典型有機磷酸酯顯著誘導河蜆細胞凋亡。 關鍵詞：河蜆，miRNA，有機磷酸酯，凋亡通路，生物標志物 ABSTRACT Biological monitoring is an important part of environmental monitoring. Currently the environmental monitoring in China mainly depended on the chemical analysis and monitoring. In recent years, although the internationally biological monitoring technology development is rapid, based on restrictions of our standard of environmental monitoring, the development of biological monitoring in our country has been in the research stage. Currently, biological monitoring manly relies on algae, Daphnia and fish aquatic species, for large benthic current monitoring depends only on biodiversity survey. Therefore, it is urgent to develop aquatic laboratory animals in our country, particularly to strengthen the screening of large benthic biomarkers and modeling study. Therefore in this study the widespread mollusk-Corbicula fluminea in our country was taken as an experimental organism, to strengthen the biological background research, we systematically study biomarkers of the Corbicula fluminea in monitoring environmental pollutants. Finally, we discuss mechanism of environmental pollutants on Corbicula fluminea through the above markers. The main research contents and results are as follows: 1) Through Illumina sequencing we obtained the Corbicula fluminea miRNA biological information, and obtained the 28799934 high quality sequences, then identified 45 conservative and 39 new Corbicula fluminea miRNAs; Fluorescence quantitative PCR results showed that nine miRNAs of 12 were expressed highest in the gastropod, while miR-10 and Novel-2 was expressed highest respectively in gill and visceral mass; Software prediction results showed that miRNAs related to environmental pollution genes, this provides a molecular biological basis for Corbicula fluminea as an experimental organism. 2) Through RACE technology, we successfully cloned the Corbicula fluminea the full-length cDNA sequence of CCK, Conopression and FFamide, predicted the molecular structure of Corbicula fluminea CCK, Conopression and FFamide protein, and analyzed the distribution of neuropeptide expression in different tissues of Corbicula fluminea; the organic phosphate significantly increased the expression of neuropeptide, indicating that the CCK, and Ffamide Conopression can be taken as Corbicula fluminea biomarkers and this provides a technical means for the biological monitoring of environmental pollutants. 3) By combining with transcriptome sequencing technology and fluorescence quantitative PCR we analysis  the toxicological mechanism of typical organic phosphate(TDCPP and TBP), Multiple indicators showed that long-term low-dose exposure mainly effect apoptosis pathway, focal adhesion pathway, small cell lung cancer pathway and cell adhesion molecular pathways, the detect of caspase enzyme activity and apoptosis related genes confirmed that typical organic phosphate significantly induced Corbicula fluminea cell apoptosis.   Key Words: Corbicula fluminea, miRNA, organophosphates, apoptotic pathways, biomarkers 1.1 生物標志物應用現狀 隨著人類工業化進程的增加，環境中的污染物越來越多，對人和動植物的健康造成了潛在威脅，大量研究表明，水體中的污染物隨著營養能級的提高，難降解、高親脂性的污染物成百上千倍的在生物體中累積[1, 2]，而作為營養級最高的人類，自然會遭受很大的環境風險，而常規的化學法監測效率低，成本高，監測品種少，難以滿足快速增長的污染物品種，因此使用生物作為監測工具，開發相關的生物標志物，對解決當前多門類的環境污染物評估具有重要意義[3, 4]。Goksoyr 等[4]首先定義了生物標志物是生物體暴露在亞致死劑量的環境污染物時，在分子、細胞等水平上發生異常變化的生理生化指標。這些指標通常是生物體早期損傷的預警，開發出相應生物標志物就能為此類環境污染物提供風險評估[5]。水生生物能實時監測水質情況，比傳統化學法更加具有優勢。我國科學家已經開發出了基于稀有鮈鯽的實時在線監測系統，目前已經廣泛的應用到我國水源地監測水質情況，為我們使用安全的飲用水提供了預警，運用了稀有鮈鯽對污染物的敏感特點。 汪紀倉等[6]研究了在鎘誘導大鼠肝細胞凋亡中的氧化應激作用，發現醋酸鎘通過ROS導致肝細胞凋亡并導致氧化損傷，不是通過caspase途徑，ROS才是鎘的生物標志物。熊力等[7] 研究五氯酚(PCP)對稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)胚胎的致畸作用和毒性效應，發現p53基因和CYP1A基因的誘導表達可以作為評價PCP毒性作用的生物標志物。陳輝輝等[8]使用河蜆為受試生物，開發出了氟西汀的相關生物標志物，發現河蜆在氟西汀暴露下，ATP結合轉運蛋白基因受到抑制，而且超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛酶活性升高，指示了氟西汀的效應。Cooper等[9]將河蜆暴露在不同濃度毒死蜱下，發現乙酰膽堿酯酶活性是毒死蜱的生物標志物，其活性在高濃度受到明顯抑制。相比較而言，河蜆等底棲生物的研究比較少，相關研究也主要是常規標志物，但底棲生物能直接反應水體污染現狀，開發我國淡水底棲生物的神經肽類生物標志物并將其運用到環境評價，監測上去具有十分重大的意義。 1.2 microRNA與生物標志物 1.2.1 microRNA背景介紹 MicroRNAs (miRNAs) 是內源性的小無編碼RNAs（典型的19到23個核苷酸），通過在轉錄或后轉錄水平剪切或抑制翻譯動植物mRNAs來調控基因的表達[10]。自從第一個miRNA（lin-4）在線蟲中發現以來[11]，大量的miRNAs通過克隆和小RNA測序在不同的物種中被發現[12-16]。目前大約有28645個成熟體miRNAs在223個物種中鑒定出來[17]，人類中發現的miRNAs最多達到1881個前體[18]。在硬骨魚中總共有1637個成熟體被發現[17]。在軟體動物中僅僅發現69個miRNAs[17]，此外，在珍珠貝中發現258個[19]，在牡蠣中發現199個[20]，然而淡水軟體動物（如河蜆）還沒有miRNAs的相關報道。 近期研究表明miRNAs與器官發育，細胞分化，細胞凋亡有關[21-24].55個miRNAs在牡蠣中被發現可能調控免疫反應[25, 26]。此外。37個櫛孔扇貝miRNAs能應答AVNV感染[27]。而且，厚殼玉黍螺胰腺中的miR-29b和腹足中的miR-2a能在自然結冰或缺氧條件下應答[28]。Jiao等[29]通過計算預測方法預測了珍珠貝候選的miRNAs和它們在生物礦化作用中的潛在功能。盡管有計算方法報道過軟體動物miRNAs的功能，但淡水軟體動物的還不清楚。 Solexa測序是一種測短片段序列的技術[30]，目前已經廣泛的在不同物種中用來鑒定保守的和新的miRNAs[31-33]。與傳統的miRNAs鑒定方法（計算預測和直接克隆）相比，Solexa測序可以用來發現保守的和低豐度非保守的miRNAs，甚至在沒有基因組數據的情況下[34]。 1.2.2 microRNA生物標志物 毒理學研究表明,在環境污染物影響下,生物體相關miRNA表達會發生變化,相應的其靶基因表達也會發生改變。因此在環境毒理學研究中，miRNA可作為識別環境中污染物的生物標記物。王法琦等[35] 使用miRNA芯片技術研究了PFOS暴露下，出生一天和七天大鼠腦組織miRNA表達的變化，結果表明PFOS暴露下出生一天和七天的大鼠腦組織分別有24和17個miRNA表達量發生了顯著性差異。通過分析得出PFOS暴露可能對大鼠子代大腦學習記憶能力造成威脅，并且miR-207、miR-297、miR-466b、miR-672和miR-674-3p可能在調控中發揮作用。李鹿豐等[36]研究了在氟蟲腈作用下異位表達的miR-155對斑馬魚胚胎細胞ZF4存活的影響，結果表明，72h氟蟲腈暴露下，瞬時轉染miR-155可以顯著降低ZF4細胞的存活率，其潛在靶基因cyb561d2表達顯著降低。得出miR-155可作為氟蟲腈環境毒性的潛在的生物標志物。Malik等[37]研究了不同劑量苯并芘28天暴露后小鼠肝臟mRNA和miR-34a表達的變化，結果表明50和75 mg/kg/day BaP暴露后miR-34a表達量相對于空白組分別顯著性升高了2被和3.6倍，而其他miRNA沒有觀察到顯著性變化，這個miRNA是與P53應答相關聯。 目前關于miRNA的毒理學研究主要集中在哺乳動物，而水生動物特別是底棲動物沒有相關研究，miRNA背景學資料相當缺乏，底棲生物能直接反應水體污染，其miRNA毒理學研究沒有報道，急需進行相關研究。 1.3 轉錄組測序技術與生物標志物 1.3.1 轉錄組學概述 轉錄組是特定發展階段或生理條件下一個細胞中所有轉錄本的總和，轉錄組對了解基因組的功能，揭露細胞和組織的分子成分，了解發育與疾病具有重要意義。轉錄組學到重要目的在于：記錄物種的所有轉錄本，包括mRNAs，非編碼RNAs和小RNAs；決定基因的起始位點，5’和3’轉錄結構，剪切類型，其他轉錄后的變化；量化每個轉錄本在發育或其他不同條件下的表達改變水平。對于非模式生物，因為缺乏相關基因組信息，其遺傳育種，生命特征等研究進展緩慢，傳統的cDNA克隆，基因芯片技術耗時長，效率低，已經無法滿足高速發展的生物信息學技術。 1.3.2 轉錄組測序技術 隨著測序技術的發展，第二代測序技術成為很好解決非模式生物基因信息學的一個工具，與傳統基因芯片，克隆技術相比，不用知曉基因片段信息。轉錄組測序技術檢測轉錄本的精確度達到單核核苷酸水平，不僅可以分析基因表達水平和轉錄本的序列，而且能檢測稀有轉錄本和未知序列，提供豐富的轉錄組信息，為我們認識真核生物轉錄組信息提供了快速，高效，精確的測序技術。目前，已有人類細胞[38]，老鼠[39]，斑馬魚[40]，河蜆[41]，擬南芥[42]，啤酒酵母[43]進行了轉錄組測序和分析，為在基因水平研究這些物種提供了生物信息學基礎。 目前，二代測序平臺主要有三個，如ABI公司的(AB SOLiD)、Illumina 公司(Genome Analyzer II) 和Roche 公司(454 GS-FLX)，后來，單分子測序(Single molecule sequencing, SMS)技術由Helicos Biosciences 公司推出。一個重要特點就是高通量，數以千萬計的reads被測序。下表列舉了這三個平臺的異同點。 表1-1 幾種測序平臺優缺點 測序平臺 Illumina/Solexa GA IIx ABI/SOLiD SOLiD3 Roche/454 GS FLXHelicos HeliScope 測序原理可逆染料終 結合成測序連接測序焦磷酸合成 測序 單分子合成 測序 平均讀長(bp)10035 400～700 21~35 運行時間(d/run)3~107 0.55 美元/Mb堿基0.050.15151 主要錯誤類型替換 替換缺失與插入缺失 準確率≧98.5%≧99.94% ≧99.9% ≧99% 優點性價比高準確率最高運行速度快，讀長最長產量高 缺點讀長短 運行時間長，讀長短錯誤率高，性價比低錯誤率高 本論文以Illumina公司的Hiseq2000測序平臺為例，轉錄組測序技術測序流程主要包括[44, 45]：1、RNA樣品準備與質量控制；2、mRNA的純化與片段化；3、cDNA文庫第一鏈的合成；4、cDNA文庫第二鏈的合成；5、末端修復與加A；6、PCR擴增；7、瓊脂糖凝膠的純化；8、cDNA庫的質量控制；9、簇生成；10、上機測序并分析。流程圖如下： 圖1-1 Illumina Hiseq2000測序平臺流程圖 轉錄組測序結果數據量巨大，往往需要使用專業的生物信息學分析，對測序得到的原始 reads（雙端序列）進行質量評估和過濾后，將高質量的 reads 進行轉錄本的組裝，對轉錄本進行結構注釋和功能注釋。把 clean reads 回帖到參考序列上，再基于回帖結果進行表達量分析、差異表達基因功能注釋等高級分析。一般主流的比對數據庫有：美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information, NCBI），歐洲生物信息學研究所（European Bioinformatics Institute, EMBI），COG（Clusters of Orthologous Groups）蛋白數據庫，KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes database）數據庫。數據分析流程圖如下： 圖1-2 測序數據分析流程圖 1.3.3 轉錄組測序技術在環境毒理學上的應用 目前在環境毒理學上轉錄組測序技術有兩個方面的主要作用：分子標記物的篩選與鑒定；環境中不同污染物對水生生物的毒理學效應和機制。Huang等[46]分析了全氟辛烷磺酸（PFOS）暴露后的青鳉轉錄組數據，發現青鳉蛋白和脂肪代謝，線粒體功能和神經系統等通路受到了影響；陳輝輝等[41]在2013年報道了氟西汀暴露后河蜆的轉錄組數據分析結果，鑒定了9383個差異轉錄本，發現氟西汀的主要影響河蜆的ABC跨膜蛋白，谷胱甘肽代謝，類固醇合成代謝和細胞自噬作用的通路。總之，轉錄組測序技術在環境毒理學研究中具有很大優勢，不僅可以獲取受試生物高通量生物學信息，還能鑒定差異轉錄本，深入研究環境污染物的毒性效應和機制。 1.4神經肽與生物標志物 1.4.1 神經肽定義，分類與功能 神經肽是一系列不同類的細胞信號分子，由神經元細胞通過調控分泌通路產生和釋放[47]。它們在功能上起到神經激素，神經遞質和神經調質的作用。作為神經活動的調質，神經肽將神經信號在上下游神經元細胞間傳遞[48]。神經肽還可以作為激素經由神經器官的網絡釋放到血淋巴中在調節各種生理狀態，包括生長、代謝和繁殖[49]，例如腦啡肽作為神經遞質在腦參與外圍活動包括免疫細胞功能的調節[50, 51]。 第一個神經肽P物質是在上個世紀早期發現，首先從馬的大腦和腸道中粗略的提取出來，并且發現它具有強力的降血壓和緩解肌肉收縮的作用[52, 53]。對神經肽嚴肅而專注的研究已經超過30年，大量的神經肽和它們的家族已經在脊椎和無脊椎動物中鑒定出來，如人，老鼠，豬和章魚，這些研究對理解它們的功能和特征起到了很大的作用[54]。目前神經肽按家族可以分為：速激肽、下丘腦神經肽、垂體后葉激素、內阿片肽、高血糖素相關肽、神經肽Y記憶家族、內皮素家族、心房肽家族以及鈴蟾樣肽家族[55]。在無脊椎生物中，許多神經肽也被發掘出來，有抗菌肽、阿片肽、縮膽囊肽等十幾個肽家族[47]，而且目前還在不斷擴充中，在功能上起到控制生殖，攝食，肌肉收縮，免疫等[50, 56-58]作用。例如FMRF神經肽作為在海蝸牛中發現的最著名的，起到生理上控制鰓的作用[59]，而且通過免疫組化定位與高效液相色譜法發現在心臟組織中存在[60]。在基因組數據的挖掘和神經系統組織肽分析的幫助下，牡蠣的神經肽研究得到了極大提升[61]。 腸促胰酶肽（Cholecystokinin (CCK)）首先被Mutt和Jorpes于1968年發現并命名[62].在脊椎動物中，CCK廣泛的分布于腦，據文獻報道能減少鳥類，嚙齒類動物，豬，羊，非人類靈長類動物以及人的食物攝入[47]。通過調控飽腹感中心來達到調控進食的作用[63, 64]。在軟體動物在，CCK可能與一些綜合感官功能有關，例如進食相關的行為，在感覺和神經激素間的通信[65-68]. 文獻HgCl2可以促進CCK的免疫熒光反應[69, 70]。   Conopressin神經肽，首先在錐形蝸牛的毒液中發現[71]，隨后在其他幾個無脊椎動物中冶發現，例如牡蠣和蝸牛[56, 72]。文獻報道Conopressin與靜水椎實螺雄性的交配行為調控有關，在交配期間通過刺激輸精管中平滑肌自發性收縮最終導致精子的噴射[73]. 神經肽FF 1985年從牛的大腦中分離出來[74]，是Rfamide肽家族的一員 [57]，而這個神經肽的生物學功能包括痛覺調控，食物攝取，胃腸道和激素的調控，阿片類藥物耐受與成癮和心血管行為的調控[58, 75, 76]。而在軟體動物中，文獻報道于1995年從靜水椎實螺獲取FF神經肽的結構是GLTPNMNSLFF-amide，并且該神經肽調控輸精管中精子的轉移速率[77]。 1.4.1神經肽標志物 Lodhe[70]等使用HgCl2和ZnCl2暴露淡水螺后發現，HgCl2的毒理效應比ZnCl2更加與CCK的行為和免疫反應有關。進一步的實驗表明HgCl2能使神經元中粘蛋白含量上升和CCK免疫反應增強，并隨著時間推移越來越強[69]。MacDonald[78]等通過給眼斑鰩2周饑餓處理，發現端腦的NPY和腸道中的CCK神經肽基因表達水平升高，但是下丘腦中NPY和CCK表達水平沒有受到影響，總之，神經肽在環境毒理學上的應用也非常少，環境污染物對神經肽的干擾效應也未知。淡水雙殼軟體動物（例如河蜆）的神經肽研究目前也沒有報道，急需進行生物標志物的開發。 1.5 有機磷酸酯 1.5.1 有機磷酸酯介紹 自從一些溴代阻燃劑被禁用以來，有機磷酸酯(organophosphorus flame retardants，OPFRs)阻燃劑因其具有良好的阻燃特性，產量大，具有可塑性，易生產，而被廣泛的使用，如電子、裝飾，化工，紡織等行業，因其是直接混入材料中，有機磷酸酯極易釋放到外界環境中，從大氣，水體，土地，生物體內都監測到有機磷酸酯的存在，而相關研究表明，有機磷酸酯性質穩定，難以降解，具有環境持久性，毒理學研究表明OPFRs具有明顯的致癌性，基因毒性和神經毒性，并能刺激人的皮膚[79-83]。Wang[84]等使用10, 50, 100, 300和600 μg/L TDCPP暴露斑馬魚胚胎，發現暴露引起了體重的減少，孵化率，存活率和心跳速率降低，增加了畸形率，進一步的分子實驗表明TDCPP能顯著性降低甲狀腺激素水平，而增加整體甲腺原氨酸水平，引起了甲狀腺內分泌干擾效應。Liu[85]等將斑馬魚暴露在TDCPP和TPP 21天后發現成魚體中17β雌二醇，卵黃蛋白原水平顯著上升，相關的CYP11A，CYP17，GnRH基因表達量都發生改變，得出TDCPP和TPP通過改變下丘腦-垂體-性腺軸調控機制而干擾性激素的平衡，最終達到干擾斑馬魚生殖行為。有機磷酸酯在結構上類似有神經毒性的有機磷農藥[86]，而在人居環境中大量存在有機磷酸酯，對人體健康有著潛在的危害。Dishaw[86]等通過在幾種典型有機磷酸酯中暴露PC12細胞發現這些OPFRs比四溴聯苯醚具有更強的神經毒性。Meeker[87]等初步研究表明有機磷酸酯能影響人激素水平并降低精子活性。 1.5.2 四種有機磷酸酯 磷酸三(2,3-二氯丙基)酯（tris(2,3-dichloropropyl) phosphate，TDCPP），使用量最廣泛的有機磷酸酯阻燃劑，據報道在美國TDCPP從1998年的年產量4500噸快速增加到2006年的22700噸[88]，環境中頻繁的檢測到了TDCPP的存在，如室內空氣，灰塵，地表水，飲用水，河流，污水，沉積物和生物群體[88]。例如在地表水，報道TDCPP達到50 ng/L[89]，而更高濃度的TDCPP在德國和挪威的污水處理廠出水中監測到，從20 ng/L到740 ng/L不等[88-90]。而在生物體中，發現TDCPP在鱸魚體中達到36–140 g/kg脂肪重量[91]。在中國的松花江和太湖的沉積物中都檢測到了TDCPP，濃度分分別是2.5-40 ng/L和0.62-5.54 g/kg[92, 93]。而目前關于TDCPP的毒理學機制相關文獻報道非常有限。急性毒性結果表明TDCPP毒害作用比其他OPFRs更強，虹鱒96小時半致死濃度是1.1 mg/L[94]，而斑馬魚胚胎116小時半致死濃度是7.0 mg/L[81]。 磷酸三丁酯（Tributyl phosphate，TBP），廣泛在核處理，化學工業，防火材料中使用的有機磷酸酯[95, 96]，據報道引起了工人的惡心和頭痛[97]，環境中廣泛存在，甚至在人血液和牛奶中也有檢測到[98, 99]。而在海洋底部以從底泥和碎屑中覓食的底棲生物體內，發現腸道和肉中TBP最高含量分別為230 ng/g濕重和12 ng/g濕重[100]。但是目前人們對TBP的毒理認識還不足。 磷酸三（2-氯乙基）酯（Tris-(2-chloroethyl)-phosphate，TCEP）是一種典型的OPFRs，目前已經被列為痕量污染物名錄[101]，在世界范圍內廣泛的用于液體不飽和聚酯樹脂的合成，紡織品背面涂層，PVC，纖維素酯化合物以及涂料[94]。TCEP曾經在1998年產量高達9000噸，但在1997年降至4000噸[101]。然而，TCEP作為一個典型的痕量污染物因為很低的去除率[102, 103]，目前在地表水，污水處理廠出水，海洋和飲用水中濃度從ng/L到μg/L[89, 104]。對TCEP的毒理學研究已經在神經毒性，致畸性，致癌性上有所發現[105-108]。因此環境濃度的TCEP的潛在影響絕大多數還不清楚。 磷酸三（丁氧基乙基）酯（tris(2-butoxyethyl)phosphate, TBEP）也是一種廣泛使用的OPFRs，Meyer[102]等通過檢測德國某污水廠出水發現TBEP含量為 2400-6100ng/L，每年全世界的產量為5000到6000噸[94]。Sager[109]等發現TBEP可能結合β腎上腺素轉運蛋白而影響β腎上腺素信號系統的生物學過程。目前對TBEP的毒理學研究非常少。 1.6河蜆的生物學背景及其在環境毒理學研究上的應用 1.6.1 河蜆的生物學背景 河蜆俗稱黃蜆、沙喇、沙螺、蟟仔、蝲仔拉丁名（Corbicula fluminea），一種雙殼貝類，原產于我國、日本、朝鮮、東南亞各國[110, 111]，隸屬軟體動物門，瓣鰓綱（Lamellibranchis），真瓣鰓目（Eulamellibranchia），蜆科（Corbiculidae），蜆屬（Corbicula）。是我國重要的淡水經濟貝類之一，在20世紀初由移民傳入歐洲和北美，由于當地淡水環境很適合河蜆生長繁殖，且河蜆因其有雙殼嚴密保護，環境適應能力極強，在當地的河流，湖泊，濕地大量繁殖，已經被歐洲和北美列為外來入侵物種[112-114]。 河蜆喜歡穴居，以水底泥，沙作為理想棲息環境，因生活的底泥顏色差異而形成黃色和黑色，殼硬且厚，長約1.5～2.8cm，呈圓底三角形，殼頂部向外膨脹，殼面泛有紫色光澤，具有類似同心圓的生長輪脈，適宜生長水溫為9-32℃[115]，以水中有機碎屑，浮游生物等為食，食性雜，通過鰓濾食食物[116]，是一種底棲生物，目前，在我國淮河，黃河，長江，江蘇洪澤湖，洞庭湖等淡水水域，河蜆大量分布，在江浙，廣東和福建等地，河蜆被大量養殖。河蜆不僅味道十分鮮美，營養價值很高，而且蜆肉可入藥，能明目，通乳，利尿，開胃和解救，對心臟病，肝病，高血壓具有顯著效果[115, 117]，具有極高的經濟價值和藥用價值，在海內外特別是韓國日本市場很熱銷。 1.6.2 河蜆在環境毒理學上的應用 雙殼軟體動物因其長期生活在水中，活動能力緩慢，捕撈方便，接觸水底底泥并對水中污染物具有很強的富集作用，是很理想的水體污染指示生物，一直是環境毒理學研究的實驗生物[118-120]，目前以牡蠣，紫貽貝，菲律賓蛤等海洋貝類在環境毒理學中的研究比較多[79, 121, 122]，而淡水貝類特別是我國河蜆的環境毒理應用研究報道比較少。河蜆在我國以及世界淡水環境中分布非常廣泛，當前對其的研究主要是繁殖、形態、營養學和少量毒理相關研究。 河蜆作為我國本土淡水雙殼貝類，是很好的環境毒理學指示性生物[123]。在我國淡水水域分布極為廣泛，數量豐富，容易捕撈，與底泥長期直接接觸，可以很直接的反應我國各水體污染狀況，而且已經建立實驗室馴養和暴露測試體系[8]。先前的研究已經報道過河蜆對水中污染物的高度敏感性[124, 125]。 目前，國內外對河蜆在環境毒理學上的研究主要有以下3個方向：1）河蜆對水體污染物的生物富集效應，Arini[126]等研究了河蜆暴露在Cd，Zn后的回復能力，結果表明一年后僅僅73%的Cd被從河蜆體中排出，而Zn很快就被凈化掉。Mark[127]等研究了紡織廠下游河流里河蜆體中的污染物富集情況，發現河蜆體中α-和β-HBCD比沉積物中高。李天云[125]等研究了河蜆對天津排污河道多環芳烴和有機氯農藥的富集效應，發現河蜆對有機氯農藥的生物-沉積物富集因子為1.79±0.22，而對多環芳烴的富集因子范圍是0.021-0.147。以上報道顯示了河蜆具有較強的有機物和重金屬的生物富集效應。2）對水環境的實時生物監測，目前研究表明河蜆在水體環境惡化時會關閉雙殼形成密閉空間來保護自己[128]，這種閉殼保護系統已經運用到污染物的生物監測上，Damien[129]等研究了Cd與河蜆閉殼效應的關系，并在殼上安裝電極來實時監測污染狀況，Damien[130]等研究河蜆對Cu的閉殼應答關系。3）水中污染物的毒理學研究，國內外研究主要集中在環境污染物對河蜆的毒理效應和毒理機制，評價污染物有微囊藻毒素，有機污染物，內分泌干擾物，重金屬，個人護理用品等[8, 9, 131-134]。陳輝輝[123]等研究了卡馬西平對河蜆的毒理學機制，發現5和50 μg/L卡馬西平暴露后，河蜆Hsp22，Hsp27，Hsp40，Hsp70和Hsp90基因表達量顯著性上調，而Hsp60基因表達受到抑制。Aurélie[133]等研究了河蜆對Cu和Cd的早期應答反應，結果表明消化腺中金屬硫蛋白基因顯著上調，而SOD，CAT，SeGPx和p-GST表達水平降低。 以上研究報道為我們研究水中污染物對河蜆的毒理學效應和機制提供了理論基礎和科學依據。 圖 1-1 常見雙殼類的內部結構示意圖（圖示為中國蛤蜊） 1.7 實驗的目的和意義 目前，國內外已經研究神經肽30多年，在人，老鼠上研究的比較成熟，而在無脊椎動物中的研究也是一直關注的重點，但是大多集中在海洋軟體動物和陸生無脊椎動物，沒有淡水雙殼貝類的相關研究，且環境污染物對神經肽的研究報道非常少。近年來隨著溴代阻燃劑的禁用，有機磷酸酯作為一種新型阻燃劑被應用到生活生產的方方面面，而相關文獻報道OPFRs對人類健康有潛在的風險，人們對OPFRs的關注度也越來越高，但是對OPFRs的毒理學研究還非常少，對OPFRs的危害評估體系尚不健全。急需建立生態安全評估體系。在生態毒理學受試生物研究上，國內外已經開發了多種受試生物品種，如斑馬魚，大型溞，浮萍，虹鱒，牡蠣，稀有鮈鯽和青鳉等[135-141]，但是關于淡水雙殼類底棲生物的報道很少，河蜆作為中國本土的底棲物種，分布廣，敏感性強，易取樣，能直接反映水污染現狀。 本研究通過Illumina測序技術獲取河蜆miRNAs信息，為研究miRNA在環境毒理學上的應用提供了基礎。利用RACE技術，克隆典型河蜆腸促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神經肽和FF神經肽基因，并進一步選取了具有神經毒性的污染物有機磷酸酯，篩查敏感的神經肽標志物，為神經肽的毒理學研究與應用提供了科學依據。使用轉錄組測序技術評估TDCPP和TBP對河蜆內臟團的毒理機制，為我國對TDCPP和TBP的風險評估提供依據。本論文的技術路線如圖1-1。 圖1-1 本論文的技術路線? 第二章 基于Solexa技術的河蜆保守和新microRNA的鑒定與特征分析 2.1 引言 河蜆作為我國本土淡水貝類是生態毒理學研究的優勢物種，陳輝輝等[142]通過轉錄制測序發現了一些環境標志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前還沒有河蜆環境相關miRNAs的報道。 因此在本研究中，我們使用Solexa測序技術鑒定了河蜆中的miRNAs。此外還使用熒光定量PCR測定了特定miRNA轉錄本在不同組織中的表達情況，兩種法則被用來預測miRNAs的潛在目標，本研究提供了河蜆miRNAs數據，為以后研究河蜆miRNAs的生物學功能和進化提供了技術。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蜆的養殖 河蜆取自洪澤湖，養殖方法見附錄1 2.2.2 miRNA的提取與測序 首先使用天根miRcute miRNA提取分離試劑盒對河蜆miRNA進行提取，然后在3’和5’接頭加上測序序列，接著進行反轉，建庫，PCR擴增，使用聚丙烯酰胺凝膠分離純化145-160nt的小RNA，加接頭，最后上機測序。提取與測序流程如圖2-1。 圖2-1 miRNA庫建立與測序 2.2.3 miRNA測序數據生物信息學分析 由Solexa測序產生的單個序列通過FASTX工具進行數據過濾，評估序列質量去除低質量序列和3’接頭，5’接頭和多A序列，計算小RNA長度分布[143, 144]。余下的干凈序列使用blast搜索比對到牡蠣基因組上[145]。接著使用BLASTN將有意義的匹配序列比對到Rfam數據庫[17]注釋rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比對到miRBase 21中的后生動物成熟miRNAs庫。一樣或與參考的成熟miRNAs相關的序列被認為是保守miRNAs。沒有匹配到任何數據庫的序列被比對到牡蠣基因組用來預測新miRNAs。與牡蠣基因組沒有任何差別的序列通過MIPEAP折疊來確定為潛在的新miRNAs。使用了如下法則來確定新miRNAs：堿基的數量為18到24，自由能≤-20 kcal/mol，并且miRNA從一個前體端產生。Solexa測序在牡蠣比對中形成miRNA: miRNA*對被認為是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鑒定與表達分析 為了鑒定深度測序獲取的miRNAs，我們隨機選取了8個保守的和4個新的miRNAs，以5S rRNA為內參使用熒光定量PCR分析了他們在四個組織中的表達情況，總RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen, China)試劑盒來提取，定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen, China)，定量儀使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology, USA)，定量引物使用miRprimer軟件[146]設計，見表2-1。 表2-1 河蜆miRNA定量使用的引物 miRNAforward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggtggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatgggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactgaccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaaggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgaggtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 2.2.5 目的基因預測分析 John等[147]報道過的目的基因預測方法。盡管河蜆基因組和EST序列缺乏，但是有4個環境相關的基因全長(gst-pi, hsp70, cyp4 and metallothionein)可以從ncbi上獲得，使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]對miRNAs和這四個基因的3’非翻譯區作了目標預測。 2.3 結果與分析 2.3.1 miRNA序列分析 我們使用河蜆外套膜，肌肉，消化腺，性腺和鰓的RNA樣品建立了一個小RNA庫用來獲取河蜆的miRNAs信息。過濾掉低質量的和接頭序列，清楚污染的和短序列后，我們獲得了28,799,934條高質量的reads。這些干凈序列然后被映射到牡蠣基因組。得到了代表39813個序列的6194289個高質量reads（表2-2）。去除掉rRNA, tRNA, snoRNA和其他ncRNA序列，剩下的4995304 reads（代表16144個 不同的reads）被用來預測保守的和潛在的新miRNAs（表2-2）。不同類型的小RNAs的數量和比例如表2-2。 尺寸是一個重要的特征用來區分miRNAs和其他小RNA[150]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如圖2-1。我們發現絕大多數是22bp，占了總reads數的14.4%。同樣地，在斑點叉尾（25.8%）[143]和珍珠貝中（34.48%）[29]也是22bp的最多。 圖2-1 高質量reads長度分布 表2-2 河蜆中不同類型小RNAs長度分布 Small RNAUnique RNAsPercent (%)Total RNAsPercent (%) Total39,813100 6,194,289100 rRNA 11,262 28.29 1,048,53816.93 tRNA2,1245.33 22,2890.36 snoRNA 19 0.05 1830.00 other10,26425.78127,975 2.07 miRNA 16,14440.55 4,995,304 80.64 2.3.2 河蜆保守miRNAs確定 為了確定河蜆保守的miRNAs，我們將測序數據比對到在miRBase 21中的后生動物miRNAs庫，允許有1到2個錯配堿基[152]。總共16144個唯一的序列被比對到數據庫。屬于35個miRNAs家族的45個保守的miRNAs被鑒定出來（附錄4）。此外，這些結果顯示有26個保守的miRNAs超過1000測序數。miR-10測得1304866個拷貝數，是最多的，緊接著是miR-184（258355），miR-315（220094）和miR-7（144322）（附錄2）。在這些保守的miRNAs中，15個只有低于100個拷貝數。miR-67a和miR-67b只被檢測到1次。 2.3.3 河蜆新miRNAs的鑒定 因為河蜆基因組信息未知，所以我們使用牡蠣基因組和河蜆EST數據庫用來預測新miRNAs[153]。44個符合規則的小RNAs被認為是潛在的新miRNAs。它們二級結構的自由能從?20.10到?99.00 kcal/mol（附錄3）。有28個新miRNAs被檢測少于100個拷貝，15個新miRNAs少于10個拷貝。預測的5個表達最高的miRNAs的二級結構如圖2-2。               圖 2-2 5個表達最高的新miRNAs預測二級結構 2.3.4 河蜆miRNAs的熒光定量 為了檢測河蜆潛在miRNAs的組織分布，我們使用熒光定量PCR檢測不同miRNAs在不同組織中的表達水平。特別地，4個新的(Novel-2, Novel-14, Novel-18 and Novel-31)和8個保守的(miR-10, miR-12, miR-67a, miR-184, miR-216a, miR-216b, miR-1985 and miR-1992)（圖2-3）miRNAs被檢測了表達水平。 結果顯示9個miRNAs在腹足中表達量最高，然而miR-10和Novel-2在鰓和內臟團中表達量最高。此外，miR-1992在所有組織中表達相似。廣泛的表達說明這個miRNAs肯與基礎功能有關如代謝[154]。相比較而言，一些miRNAs高度顯示了組織特異性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高，接著是外套膜，鰓和內臟團。此外，我們發現miR-12主要在腹足中表達，然后依次是內臟團，鰓和外套膜。miR-216b主要在腹足和內臟團中表達而在鰓和外套膜中表達稀少。而且，miR-184和miR-10表達水平在鰓，腹足和外套膜中幾乎一樣，在內臟團中明顯低。而在新miRNAs中，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表達豐富，在 鰓和內臟團表達量低。Novel-31在腹足中表達量最高，接著是外套膜和鰓，而在內臟團中非常低。Novel-2在鰓中很少表達，但在腹足外套膜和內臟團中表達高。 圖2-3 8個保守和4個新miRNAs在河蜆4個組織中（鰓，腹足，內臟團，外套膜）的表達水平 2.3.5 河蜆miRNAs目的基因的預測 為了了解河蜆保守和新miRNAs的生物學功能，我們使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和環境污染相關mRNA的關系。miRanda是一個基于核苷酸互補配對的miRNA目標基因預測軟件，這款軟件允許G=U假陽性，這在預測RNA:RNA復合體很關鍵[155]。可以用于人，老鼠，蒼蠅和蠕蟲的序列預測[156]。相比較而言，RNAhybrid是一款簡單，快速并且靈活的任何物種miRNAs目的基因預測的軟件[156]。這個工具能預測miRNA和mRNA的最佳結合位點，能計算雜交結構自由能。 結果顯示所以的環境相關基因都有相應的miRNA作用（表2-3），metallothionein基因是miR-7的目標。miR-1992，miR-2b和Novel-40可能與調控 河蜆hsp70有關。我們的結果還顯示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻譯區。然而我們沒有發現兩個軟件對gst-pi基因預測的交集。圖4-4顯示了使用miRanda和RNAhybrid預測miRNAs和它們的目的基因潛在的交聯關系。 圖2-4 miRanda和RNAhybrid預測miRNAs和它們的目的基因潛在的關系 表2-3 miRanda和RNAhybrid預測的河蜆miRNAs與gst-pi, hsp70, cyp4和metallothionein的關系 Genes (gene ID)miRanda RNAhybrid Conserved Novel Conserved Novel gst-pi(AY885667.1)miR-315, miR-8a, miR-8bNovel-30, Novel-38 miR-277 Novel-1*, Novel-4 hsp70(KJ461738.1) miR-1992, miR-2a, miR-2b, miR-2cNovel-40miR-1992, miR-2b, miR-34,Novel-29, Novel-40 cyp4(JQ678818.2)miR-10, miR-1992, miR-315 Novel-30, Novel-15, Novel-23, Novel-36miR-10, miR-1992, miR-1994, miR-263, miR-285a, miR-285b, miR-34, miR-7Novel-1*, Novel-14, Novel-17, Novel-29, Novel-3, Novel-4 metallothionein (EF185126.1)miR-1985, miR-315, miR-7,miR-7, miR-981Novel-20, Novel-29, Novel-31, Novel-6a, Novel-6b, Novel-8 2.4 討論 我們使用Solex測序技術獲取了河蜆miRNAs數據，并進行了分析。發現保守的miRNAs表達比較高。之前的研究表明絕大多數確定的miRNAs的序列和功能在不同物種間是保守的[157]。miR-10在河蜆中是表達量最高達，文獻報道它能抑制斑馬魚HoxB1a and HoxB3a基因[158]，David Hassel等報道了它還可以通過促進血管內皮生長因子信號轉導來調控斑馬魚和人血管內皮細胞的血管原行為[159]。而且在其他幾個物種中發現miR-10能與一系列Hox 基因共表達，能調控Hox 轉錄本的翻譯[160]。這些都將為以后研究河蜆miR-10的功能提供基礎。Xu等[161]報道了牡蠣中miR-216b主要在消化腺中表達，接下來是鰓和外套膜。Wong等[162]研究發現miR-184的過量表達可能在細胞分化過程中引起舌鱗狀細胞癌[162]。組織分布結果表明絕大多數河蜆miRNAs主要在2或3個組織中表達，僅有少數miRNAs在多組織中高度表達。 河蜆新miRNAs的表達量低， 在珍珠貝中53個新miRNAs中只有3個測序數大于100次[29]，此外，25個花生新miRNAs中只有5個檢測頻率大于1000，絕大多數測序數小于100[163]。我們的結果與之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低豐度表達表明了它們在某些組織中或特定發育階段中發揮作用。 2.5 本章小結 在本研究中，我們使用Solex深度測序總共從河蜆小RNA庫獲得28799934條高質量序列。鑒定了45條保守的和39條新的河蜆。使用熒光定量PCR驗證了8個保守的和4個新的miRNAs，發現它們在4個組織中表達各有差異。此外我們還是用了2種軟件預測了miRNAs和4個環境污染相關基因的關系。本研究的結果為深入了解河蜆和其他雙殼貝類的miRNA提供了基礎。 第三章 河蜆CCK,Conopressin和FFamide神經肽基因cDNA全長克隆 3.1 引言    目前，人，老鼠等脊椎動物的神經肽研究的比較成熟，無脊椎動物神經肽研究主要集中在海蝸牛，牡蠣，章魚等海洋軟體動物，沒有淡水雙殼類動物的文獻報道，神經肽的毒理學研究也很少，開發河蜆典型神經肽標志物，并應用于毒理學研究十分必要。本研究選取了CCK,Conopressin和FFamide神經肽作為研究基因。 本章以轉錄組測序獲取的神經肽片段為參考，運用RACE技術，成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神經肽基因的全長，對全長序列進行了生物信息學分析，使用熒光定量PCR測量了神經肽在河蜆不同組織中的表達分布，并評估了有機磷酸酯對神經肽的影響，篩查了神經肽標志物。 3.2 材料與方法 3.2.1實驗材料 3.2.1.1 試劑 TRIzol購自Invitrogen(USA）公司；熒光定量PCR試劑盒、瓊脂糖、M-MLV試劑盒、Oligo-(dT） 18、DNase I和dNTP購自Promega（USA）公司；100 bp 和 2000 bp ladder購自天根生物（北京，中國）公司；SMART RACE cDNA amplification kit 購自Clontech(USA）公司；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD20-T vector 和E.coli JM109 感受態細胞購自TaKaRa(Dalian, China）公司； 三氯甲烷，異丙醇和無水乙醇都是國產分析純。 3.2.1.2實驗儀器 Centrifuge 5804R離心機(eppendorf, USA） PowePac Basic電泳儀(BIO-RAD, USA） Gel Doc XR 凝膠成像儀(BIO-RAD, USA） 梯度熱循環儀（Veriti thermal cycle system）（Life Technologies，USA） Multiskan GO  酶標儀（Thermo Scientific，USA） 熒光定量 PCR 儀7500 Real-Time PCR system（Life Technologies，USA） 3.2.1.3統計分析與繪圖軟件 SPSS16.0 軟件，Origin8.0軟件 3.2.2河蜆的實驗室養殖 河蜆購自洪澤湖，在盱眙縣老子山鎮洪澤湖碼頭采集，殼長在1-3cm 左右，年齡在1-2齡左右。帶回實驗室用恒溫養殖系統進行馴養。采用流水養殖，建立一套恒溫的流水系統進行養殖，選用水泥池流水循環系統養殖河蜆，以水泵提供流水動力，建有過濾池和養殖池，水經過水泵從過濾池傳送到養殖池，再流回過濾池進行過濾。池底鋪粒徑為0.5 mm左右的細沙，所用水為500目紗絹過濾并充分曝氣的自來水，室內溫度使用空調控制，水溫保持在20±1oC，水質硬度在250mg/L以下, 光照周期為12h：12h，餌料采用實驗室純培養的斜生柵藻和小球藻，或者以高級螺旋藻藻粉作為餌料。河蜆實驗室養殖規范見附錄1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步驟： 河蜆組織總RNA的提取采用Trizol試劑法，在無菌和無RNA酶的超凈工作臺進行，具體操作步驟如下： (1)取50-100mg河蜆組織迅速放入預冷的1.5 ml EP管，迅速加入200-300μL冰預冷的Trizol液，然后用電動棒碾磨均勻，接著加入冰預冷的800μL Trizol液，注意樣品總體積不能超過所用Trizol 體積的10%，室溫放置5min，使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰預冷的氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15 秒，室溫放置3 min，然后放入離心機，4℃，12000轉，離心15min，吸取上層水相，盡量不要將沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰預冷的異丙醇混勻，室溫放置10min。 (4)12000 g，4°C，離心10 min，棄上清，此時RNA沉于管底。 (5)用DEPC處理過的水和無水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰預冷的乙醇，用手輕輕上下翻轉約50次，用移液器反復吸吹懸浮的沉淀。 (6)8000 g，4°C下離心5min，盡量棄上清。 (7)室溫瞭干，注意不要干燥過分，然后將RNA 溶于無核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度計檢測提取的RNA樣品純度和濃度。一般OD260/OD280>1.8時，樣品純度符合要求，其余的RNA于-80℃凍存，進行反轉錄合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA （1）用 RNase-free DNase 去除樣品中DNA污染。 DNaseⅠ消化處理反應體系(20μL） RNA 16μL DNaseⅠ2 μL 10×DNaseⅠ Buffer2μL Total volume 20 μL （2渦旋混勻后，37°C 水浴 30min。 （3）加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL，混勻，瞬時離心，65°C 反應 10min。 （4）RNA濃度采用紫外分光光度計測定A260/A280 大于1.8，其余的RNA于-80℃凍存，進行反轉錄合成。 3.2.3.3. cDNA 第一鏈的合成 首先使用Multiskan GO酶標儀對提取并去除DNA污染的總RNA進行定量，使用Promega的M-MLV反轉錄系統。主要步驟如下： （1）在一支無核酸酶污染的小離心管中加入2μg總RNA，2μg隨機引物和去離子水一共15μL，在金屬浴中加熱離心管到70℃，5min，這樣可以打開模板的二級結構。然后立即在冰上冷卻，以避免重新形成二級結構，短暫離心，使溶液歸于管底； （2）按照下列表格的順序和比例在上個步驟的離心管中加入反應體系的各個組分： M-MLV 5X Reaction Buffer 5μL dNTP混合液1.25μL Rnasin核酸酶抑制劑25Units 0.75μL M-MLV Reverse Transcriptase 200U1μL 無核酸水2μL Total volume25μL 輕彈或短暫離心混合溶液。37℃孵育60min進行反轉錄反應，然后在-20℃保存。 3.2.3.4. 3′和 5′RACE cDNA模板的合成 利用 SMART TM RACE Amplification Kit (Clontech）合成 RACE 模板。 （1）Buffer Mix 5×First-stand Buffer4μL DTT(100mm） 0.5μL dNTP Mix(20mm）1.0μL Total volume5.5μL （2）5′RACE cDNA 去除 DNA 的 RNA2μL 5′-CDS primer A1μL Sterile H2O8μL （3）3′RACE cDNA 去除 DNA 的 RNA2μL 3′-CDS primer A 1μL Sterile H2O 9μL （4）（2）和（3）兩離心管中的混合物分別混勻，短暫離心。 （5）72°C 下加熱3min，然后42°C 下保溫2min；在冰中冷卻2min后 14000g離心10s。 （6）向5′RACE cDNA中加入1μL SMARTerⅡA oligonucleotide，輕微振蕩后短暫離心。 （7）室溫下混合以下試劑： Buffer Mix5.5μL RNase inhibitor 0.5μL SMART Scribe Rererse Trancriptate(100U）2μL Total volume8μL （8）向上述混合液中分別加入（6）中的 5′RACE cDNA 和（3）中 3′RACE cDNA，終體積為 20μL。 （9）輕微振動離心管瞬時離心，42°C孵化90min，之后于 72°C下保溫 10min。 （10）加入90μL Tricine-EDTA Buffer對RACE cDNA庫進行稀釋，cDNA庫在-20°C可保存三個月，或在-80°C長期保存。 3.2.4河蜆CCK, Conopressin和FFamide神經肽基因cDNA全長克隆 3.2.4.1 3'RACE和5'RACE cDNA 擴增 根據本實驗室轉錄組測序所得的CCK,Conopressin和FFamide神經肽基因序列片段, 設計3'和5'RACE 特異性引物，引物設計采用 Primer Premier 5.0 軟件進行， 所設計的引物由上海生工生物公司合成（表4-1）。 表3-1 基因克隆與熒光定量 PCR 所用引物序列 Primer name Primer sequence (5’→3’） Application CCK-F GAACAAGCAGAATGACGGqPCR CCK-R ACTCTTCGCCCTTTTACC Conopressin-F TCACTACATCGGTGACTATAA Conopressin-R ATGTTCAGAGTTCATATTGGG FFamide-F TACCGCTATCGCAATCTTFFamide-R GAAAAGGTTTAAGACATCA UPM CTAATP管中，加入200μL裂、神經肽標志物的開發還處于起步階段，完善的標志物評估體系需要進一步建立起來； 3、目前的研究僅以成年河蜆為受試對象，以后需要建立針對河蜆受精卵、幼蜆的毒性測試方法。

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